Nguyên tắc của phương phápCách trộn hóa chấtTiến hành bội phản ứngCông thức tính kết quảCác chú ý cơ bảnTài liệu tham khảo
NGUYÊN TẮC
Phương pháp xác định kỹ năng bắtgốc thoải mái DPPHᐧ (2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl) được phát triển bởi Blois <1>. So sánh này dựa vào sự biến đổi màu của dung dịch DPPH. DDPH﮲ là nơi bắt đầu tự do bền màu tím, có điện tử không ghép đôi trên nguyên tử nito sinh sản thành hệ thống liên hợp năng lượng điện tử. Electron tự do thoải mái của phân tử nito vào DDPH﮲ lúc bắt cặp với cội hydro từ chất kháng oxyhóa làm mất đi màu sắc tím đặc trưng của gốc thoải mái DDPH﮲ trongdung dịch methanol. Kỹ năng khử nơi bắt đầu DDPH﮲ của một chất kháng oxy hóa thể hiện ở tại mức độ làm giảm màu của hỗn hợp DDPH, được xác định bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang ở cách sóng λmax = 517 nm. Dựa vào đường chuẩn xác định quý giá IC50 <2>.
Bạn đang xem: Dpph là gì
PHA HÓA CHẤT
1.Pha dung dịch DPPH
Cân 0.0056g DPPH hòa vào 5mL Methanol tinh khiết → hỗn hợp DPPH 30mM (stock 10X), bảo quản nhiệt độ lạnh, bọc bí mật bằng giấy bạc.
Khi làmthí nghiệm, trộn loãng stock 10X → 1X (3mM)
2.Pha mẫu đề xuất phân tích
Đối với chủng loại dạng rắn (cao chiết/ bột):
-Xác định dung môi nhằm hòa rã mẫu. Lấymột không nhiều mẫu, hòa trong những dung môi khác biệt (nước, methanol, ethanol, acetone,DMSO,… ). Quan gần kề lựa lựa chọn dung môi nào có khả năng hòa tan hoàn toàn mẫu cầnphân tích. Nếu đã biết mẫu của bản thân hòa chảy trong chất nào rồi, các bạn có thểbỏ qua bước này.
-Hòa tung 1000 ug mẫu vào 1 mL dung môi, nhận được dung dịch gồm nồng độ 1000ppm.
-Pha loãng bậc 2 liên tục (two-foldserial dilution) thành dãy những nồng độ khác nhau và dừng ở khoảng nồng độ từ bỏ 5 –10 ppm.
Đối vớimẫu phân tích dạng lỏng (dịch chiết):
-Định lượng chất cần phân tích trongdịch phân tách và tùy theo chất của chúng ta là nhiều loại hợp hóa học gì, sẽ có những phươngpháp định lượng không giống nhau. Ví dụ, bạn có dịch tách từ cải bắp tím và mong phântích hoạt tính của hợp chất anthocyanin vào dịch chiết, bạn thực hiện phươngpháp “pH Vi Sai” để khẳng định dịch chiết thuở đầu có hàm lượng anthocyanin là baonhiêu ppm.
-Từ dịch phân tách ban đầu, trộn loãng bậc2 liên tục (two-fold serial dilution) thành dãy các dịch tách ở độ pha loãngkhác nhau (nên làm cho từ 7 – 10 lần pha loãng). Ở bước này, áp dụng dung môi táchchiết mẫu mã để trộn loãng mẫu.
-Từ lượng chất chất gồm trong dịch chiếtban đầu, xác minh hàm lượng chất yêu cầu phân tích vào dịch tách ở từng bậc phaloãng.
3.Pha đối chứng
Nếu áp dụng đối bệnh dương là vitamin C, pha dãy nồng độ trường đoản cú 0 → 30 ppm, sử dụng dung môi là nước(Vitamin C tan giỏi trong nước)
Nếu sử dụng những đối chứng khác, cân nặng 100 ug hóa học đối triệu chứng và hòatan trong dung môi, sau đó pha loãng bậc 2 về khoảng nồng độ 0 – 5 ppm.
TIẾN HÀNH PHẢN ỨNG
Trong một giếng của đĩa 96 thêm lần lượt những thành phần sau:
·100 μl chủng loại phân tích/đối chứng/dung môi
·100 μl DPPH 3 milimet / methanol
→ phản nghịch ứng nửa tiếng trong tối, đo tỷ lệ quang tại cách sóng 750nm
Bảng sắp xếp thí nghiệm
| Mẫu phân tích | Mẫu trắng | Mẫu đối chứng dương | Mẫu đối chứng âm | |
| Dung dịch DPPH | x | x | x | |
| Mẫu phân tích | x | x | ||
| Chứng dương (Vitamin C) | x | |||
| Methanol | x | |||
| Dung môi | x |
CÔNG THỨC TÍNH
Phần trăm cội tựdo DDPH﮲ được tínhtheo công thức:
Chú thích
SCDPPH﮲ : năng lực bắt gốctự vị DDPH﮲ (%)As : Độ hấp thụ quang của chủng loại phân tíchAb : Độ hấp thu quang của mẫu mã trắngAn : Độ hấp phụ của chủng loại đối chứng âm
Tính quý giá IC50 của chủng loại thử và mẫu mã đối chứng phụ thuộc vào phương trình con đường tính giữa nồng độ cùng % hoạt tính bắt gốc tự do thoải mái của chúng, theo công thức sau:
Chú thích
IC50 : Nồng độ mẫu thử, chuẩn có thể bắt được 50% gốc tự do DDPH﮲a, b : theo thứ tự là độ dốc với hệ chắn của phương trình con đường tính giữ lại nồng độ cùng % bắt gốc tự do.
Mẫu được thựchiện tái diễn ba lần và hiệu quả được trình diễn dưới dạng giá trị trung bình ±SD
LƯU Ý
Có thể pha tùy ý nồngđộ DPPHᐧ, chỉ cầnđảm bảogốcDPPHᐧ trong bội nghịch ứng luôn luôn dư. Mặc dù vậy, mình ko khuyến khích các bạn pha hỗn hợp DPPH ởnồngđộ quá cao, vị lúc nàymàu của hỗn hợp DPPH rất đậm, bao gồm thểkhó quan gần kề sự thayđổi của màu sắc trước và sau bội phản ứng trong một vài trường hợp.
Dung dịch DPPH mẫn cảm với ánh sáng, dễ dẫn đến oxy hóa, bởi vậy các bạn không đề nghị pha quá nhiều, ví như pha dư tất cả thể bảo vệ ở nhiệt độ lạnh cùng bọc kín đáo giấy bội bạc để tránh ánh sáng, và thực hiện sau 1-2 ngày, không nên dùng lúc đã để quá lâu hoặc quan gần kề thấy màu sắc nhạt đi đối với ban đầu.
Mẫu đối chứng âm là chủng loại quan trọng, chúng ta nên lặp lại nhiều lần mẫu này trong một mẻ thể nghiệm (trên 3 lần) để hoàn toàn có thể có số liệu chính xác nhất.
Mẫu trắng quan trọng trong ngôi trường hợp chất phân tích của chúng ta có màu, đặc biệt là những chất có màu sắc gần tương đương với màu sắc của hỗn hợp DPPH (anthocyanin, astaxanthin,... ). Đối với ngôi trường hợp mẫu không màu cùng trong suốt, các chúng ta có thể bỏ qua chủng loại trắng.
Mẫu phân tích rất cần được hòa tan trả toàn, trường hợp là dịch chiết thì dịch chiết cần đồng điệu và không tồn tại cặn bẩn. Nếu phải thiết, các bạn cũng có thể sử dụng filter 0.45 um nhằm lọc mẫu trước lúc phân tích.
Dung dịch sau làm phản ứng nhằm đo OD nên đồng nhất, không có bọt khí (dễ xảy ra khi làm chủng loại vitamin C). Trong trường hợp này hoàn toàn có thể dùng đầu tip hoặc tăm để khuấy nhẹ, vứt bỏ bọt khí.
Khi thêm những thành phần phản bội ứng vào tô 96 hoặc ống nghiệm, dung dịch DPPH cần được thêm sau cùng, và bảo đảm tránh ánh sáng nhiều nhất bao gồm thể. Đối cùng với đĩa 96 các bạn cũng có thể cố gắng thao tác làm việc nhanh. Đối cùng với ống nghiệm, các bạn có thể bọc lại bởi giấy bạc. để phản ứng diễn ra ở nới không tồn tại ánh sáng. Sau thời gian phản ứng, công dụng cần được đo ngay, không nhằm lâu ngoài ánh sáng.
Phần kết quả, các chúng ta có thể nhập vào excel với tính toán bằng tay theo công thức tôi đã trình bày, hoặc rất có thể sử dụng một số phần mượt thông dụng để sở hữu được công dụng nhanh rộng nhé. Ở đây, mình đề xuất 1 phần mềm quen thuộc là Graphpad Prism.
THAM KHẢO
1.Blois MS. Antioxidant determinations by the use of a stable không lấy phí radical. Nature.1958;181(4617):1199.
Xem thêm: Đầu Số 0522 Là Mạng Gì Và Ý Nghĩa Của Nó Là Như Thế Nào? 0522 Là Mạng Gì Và Ý Nghĩa Của Nó Là Như Thế Nào
2.Kedare SB, Singh R. Genesis và development of DPPH method of antioxidantassay. Journal of food science và technology. 2011;48(4):412-422.